Эндотелиальная дисфункция, сопровождающаяся дисбалансом в функционировании эндотелия в сторону вазоконстрикторов и активации воспалительного процесса и повышением протромботических свойств, играет существенную роль в прогрессировании сосудистых нарушений. В частности, на сегодняшний день общепризнанным является тот факт, что эндотелиальная дисфункция является неотъемлемой составляющей артериальной гипертензии (АГ), способствуя развитию системных гемодинамических нарушений и формированию формы заболевания, устойчивой к проводимой фармакотерапии [1][2][3].

Основополагающее значение в патогенезе эндотелиальной дисфункции принадлежит оксидативному стрессу, который сопровождается дисфункцией фагоцитов, уменьшением активности антиоксидантной системы, разбалансировкой системы цитокинов [4][5]. Образование свободных радикалов, в частности активных форм кислорода (АФК), происходит в организме постоянно, а свободно-радикальное окисление (СРО) является важнейшим процессом. Это необходимое звено в реакциях иммунного статуса, ключевой механизм при таких биохимических реакциях, как перекисное окисление липидов и окислительное фосфорилирование. Однако в условиях нарушения функционирования системы антиоксидантной защиты и избыточной продукции свободных радикалов СРО превращается в неспецифический патофизиологический механизм. В результате этого под действием токсичных АФК происходит повреждение липидов, белков и других субстратов, что неизбежно ведёт за собой сбой в функционировании на различном уровне (ткань, орган), в том числе развитие и прогрессирование эндотелиальной дисфункции [6].

На фоне повышенной фагоцитарной активности увеличивается продукция провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1β (ИЛ-1β), фактор некроза опухоли-α (ФНО-α), интерлейкина-6 (ИЛ-6)), происходит стимуляция экспрессии на эндотелиоцитах адгезивных молекул, металлопротеиназ, запускается воспалительный процесс в интиме сосудов. В последующем ввиду воспаления сосудистой интимы возникает патологическая депрессия секреции эндогенных вазодилатирующих субстанций, таких как оксид азота (NO), простациклин на фоне увеличения проницаемости эндотелия и активации системы сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Совокупность всех перечисленных процессов обусловливает прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе и АГ [7][8].

Факт наличия эндотелиальной дисфункции как таковой традиционно выявляется у пациентов кардиоваскулярного профиля [9–12], однако в большинстве представленных в медицинской литературе исследований не изучаются иммуногенетические механизмы, ассоциированные с появлением и развитием эндотелиальной дисфункцией, и не оцениваются резервные возможности восстановления функционирования клеток эндотелия.

Несмотря на то, что высокая медикосоциальная значимость проблемы эндотелиальной дисфункции как фактора риска развития жизнеугрожающих сердечно-сосудистых катастроф в настоящее время является неоспоримой, многие вопросы в этой области остаются мало изученными в экспериментальной и клинической медицине. Всесторонняя оценка эндотелиальной функции, её механизмов и факторов, влияющих на неё, будет способствовать разработке эффективных, патогенетически оправданных подходов к профилактике, ранней диагностике и борьбе с механизмами, способствующими прогрессированию кардиоваскулярной патологии, в частности, АГ, и реализации её сердечно-сосудистых осложнений.

Цель исследования — оценка эндотелиальной дисфункции и её иммуногенетических механизмов у больных рефрактерной АГ.

В исследовании участвовало 42 пациента с рефрактерной АГ III степени тяжести (30 мужчин (71,4%), 12 женщин (28,6%)). Средняя продолжительность заболевания АГ — 9,9±0,63 лет. Возраст пациентов — от 43 до 72 лет, в среднем — 59,4±1,12 лет. Все пациенты получили необходимые сведения об этапах проведения исследования, планируемых манипуляциях и методах обследования и подписали информированное согласие на участие в исследовании. Проведенное исследование было одобрено локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России.

Для оценки функционального статуса эндотелиоцитов традиционно используется фармакологическая проба на эндотелий-зависимую вазодилатацию (ЭЗВ), основными диагностическими критериями в которой служат диаметр плечевой артерии (ДПА) и скорость кровотока (СКПА) в ней. Именно она и была проведена на первом этапе обследования пациентов. Исследование проводили в режиме двухмерного ультразвукового сканирования с помощью системы ACUSON 128XP/10 (США). В первую очередь у пациентов определяли исходные уровни ДПА и СКПА, а затем выполняли подкожную инъекцию 0,5 мл 0,01% раствора метахолина и фиксировали изменение анализируемых параметров. На следующий день больным выполняли аналогичную инъекцию метахолина и внутривенно вводили 5 мл 10% раствора аскорбиновой кислоты. После инъекций проводили измерение ДПА и СКПА для оценки ЭЗВ плечевой артерии. Если в ответ на введение аскорбиновой кислоты (то есть благодаря её антиоксидантным свойствам) в условиях уменьшения концентрации АФК и активности СРО наблюдалось увеличение ДПА и амплитуды вазодилатации, то делали вывод о сохранённой эндотелиальной метаболической резистентности. И напротив, если расширения артерии не происходило, это указывало на эндотелиальную дисфункцию и неспособность эндотелиоцитов противодействовать СРО [13].

Для анализа цитокин-ассоциированного повреждения интимы сосудов был проведён иммунологический анализ, включающий определение уровня провоспалительных (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α) и противовоспалительных (интерферона-γ (ИФ-γ), рецепторного антагониста ИЛ-1β (РАИЛ-1β)) цитокинов в крови [14]. Уровень исследуемых белков определяли с использованием фотометра Multilabel Counter 1420 Victor (Финляндия) и комплекта реактивов «ИЛ-8-ИФА-БЕСТ» (Россия) методом иммуноферментного анализа. Контрольную группу для определения нормального цитокинового статуса составили 32 здоровых донора.

Объектом для генетического анализа служила геномная ДНК из образцов цельной венозной (локтевая вена) крови. Отобранные пробы смешивались со стандартным антикоагулянтом (6% раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты), затем подвергались заморозке при температурном режиме -200С и хранились до этапа выделения ДНК методом фенол-хлороформной экстракции. В ходе генетического анализа определяли 3 полиморфных варианта генов: «-31 T/C» в гене ИЛ-1β, «-174 G/C» в гене ИЛ-6 и « 308 G/A» в гене ФНО-α.

Статистическая обработка данных выполнялась на персональном компьютере в пакете программы STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., США). Для сравнения показателей, подчинявшихся нормальному закону распределения, применяли t-критерий Стьюдента. Для сравнения не параметрических показателей использовали U-критерий Манна-Уитни. При анализе качественных показателей применяли таблицы сопряженности 2 × 2 и критерий χ² Пирсона. Различия признавались статистически значимыми при уровне p < 0,05.

Исходно (до введения метахолина) средний ДПА у обследуемых пациентов был равен 3,61 ± 0,09 мм. После подкожной инъекции его увеличение было незначительным (3,71±0,25 мм). Начальная линейная СКПА в среднем составляла 33,99 ± 4,36 см/с, а после фармакологической пробы — до 50,64 ± 1,61 см/с. Амплитуда реактивной гиперемии (АРГ) — 37,91 ± 0,19%.

Результатом проведения второй фармакологической пробы с аскорбиновой кислотой стало увеличение ДПА до 3,82 ± 0,28 мм, а СКПА — до 57,07 ± 1,83 см/с.

Сравнительный анализ индивидуальных показателей, зафиксированных в ходе выполненной пробы, позволил выявить среди пациентов с рефрактерной АГ, подгруппы с различным функциональным статусом эндотелиоцитов. Первую подгруппу составили 14 человек (33,3%), у которых введение аскорбиновой кислоты не вызывало увеличения ДПА и СКПА, а вторую — 28 обследуемых (66,7%), у которых введение антиоксиданта сопровождалось противоположными реакциями. При этом у 28 пациентов с выраженной метаболической устойчивостью эндотелиоцитов амплитуда ЭЗВ составила 8,49 ± 0,65%, а АРГ — 81,45 ± 3,12%, а у 14 больных с отсутствием резистентности эндотелия к СРО данные показатели составили лишь 3,42 ± 0,87% и 40,52 ± 3,94%, соответственно. Полученные результаты свидетельствовали о том, что у больных рефрактерной АГ при высокой метаболической устойчивости эндотелия его основная сосудодвигательная функция в условиях стимуляции эндотелиальных холинорецепторов выполнялась более активно.

Что касается результатов иммунологического анализа, то исходный цитокиновый профиль пациентов с рефрактерной АГ представлен на рис. 1–2.

Как видно из представленных на рис. 1–2 данных, у обследуемых пациентов с рефрактерной АГ содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ФНО-α в 4,15 и 10,7 раза (p < 0,001) соответственно превышало таковое в крови здоровых доноров (контрольная группа), а уровень ИЛ-1β и ИЛ-8 был снижен на 32,3% (p < 0,05) и 81% (p < 0,001) соответственно. В отношении цитокинов противовоспалительного спектра активности следует отметить, что уровень РАИЛ1β и ИФ-γ был увеличен в 2,1 и 16,6 раза (p < 0,001) соответственно.

Важно подчеркнуть, что состояние цитокинового профиля у больных с рефрактерной АГ соотносилось с функциональным состоянием эндотелиоцитов, о чём свидетельствуют данные, проиллюстрированные на рис. 3–4. Таким образом, сравнительный анализ цитокинового профиля пациентов с рефрактерной АГ при различном функциональной статусе эндотелиальной системы у пациентов с нарушением метаболической устойчивости эндотелия выявил статистически значимо (p<0,05) повышенные уровни провоспалительных цитокинов. При этом содержание противовоспалительных цитокинов в крови в подгруппах больных достоверно не различалось.

Результаты, полученные в ходе выполненного корреляционно-регрессионного анализа, выявили тесную прямую связь между показателем СКПА на фоне стимуляции холинорецепторов эндотелия и содержанием цитокинов: ФНО-α (r = 0,76, p < 0,001), ИЛ-6 (r = 0,71, p < 0,001), ИФ-γ (r = 0,69, p < 0,001).

Наконец, данные проведенного генетического анализа позволили выявить среди пациентов с рефрактерной АГ высокую частоту феномена полиморфизма. Так, его вариант «-31 T/C» гена ИЛ-1β был обнаружен у 22 (52,4%), «-174 G/C» гена ИЛ-6 — у 27 (64,3%), а «308 G/A» гена ФНО-α — у 35 (83,3%) обследуемых нами пациентов. Таким образом, наиболее часто наблюдался полиморфизм «308 G/A» в гене ФНО-α, что, очевидно, способствует прогрессированию эндотелиальной дисфункции.

В табл. 1–3 отражены результаты, полученные при оценке сопряжения резистентности эндотелия и полиморфизма в соответствующих генах цитокинов.

Было установлено, что устойчивость эндотелиоцитов к СРО у больных рефрактерной АГ была ассоциирована с феноменом полиморфизма «-174 G/C» гена ИЛ-6 (р = 0,009) (табл. 2) и «308 G/A» гена ФНО-α (р = 0,02) (табл. 3), но не была связана с полиморфным вариантом «-31 T/C» гена ИЛ-1β (χ2 = 0,44) (табл. 1).

Проведённая на первом этапе исследования сосудистая проба с метахолином, стимулирующим мускариновые холинорецепторы, позволила изучить у пациентов с рефрактерной АГ изменение артериального кровотока как маркера обеспечения сосудодвигательной функции сосудистого эндотелия. Выявленное незначительное расширение ПА свидетельствовало о наличии у пациентов с рефрактерной АГ эндотелиальной дисфункции. Дальнейшая оценка показателей артериального кровотока выполнялась в пробе с аскорбиновой кислотой — сильного антиоксиданта, способного нейтрализовать ряд АФК [13]. В результате было установлено, что в 1/3 случаев спровоцированного введением аскорбиновой кислоты ЭЗВПА не происходило, что служило доказательством неспособности эндотелиоцитов противостоять СРО даже в условиях снижения его активности. У 2/3 обследованных больных введение антиоксиданта, напротив, сопровождалось повышением ДПА и СКПА, что указывало на имеющуюся метаболическую устойчивость эндотелия и возможность выполнения основной сосудодвигательной функции при сохранении сенситивности рецепторов.

В последующем нами был выполнен анализ цитокин-обусловленного повреждения интимы сосудов, сопровождающего рефрактерную АГ. Как известно, цитокины, обладая плейотропностью, представляют собой одни из основных медиаторов, определяющих эндотелиальную функцию. В частности, провоспалительные цитокины рассматриваются как корреляты прогрессирования дисфункции эндотелия [15][16]. Обнаруженные ассоциативные связи позволили заключить наличие регуляторного воздействия иммунологической составляющей на функциональное состояние эндотелиоцитов. Повышение уровня провоспалительных цитокинов при рефрактерной АГ коррелирует с эндотелиальной дисфункцией: так, у обследуемых больных уровень ИЛ-6 и ФНО-α в 4,15 и 10,7 раза (p < 0,001) соответственно превышал контрольные значения здоровых доноров. В отношении противовоспалительных цитокинов следует отметить, что содержание РАИЛ-1β и ИФ-γ было увеличено в 2,1 и 16,6 раза (p < 0,001) соответственно, однако такое повышение, на наш взгляд, следует рассматривать в качестве компенсаторного механизма по ограничению воспалительной реакции, который активизируется вне зависимости от степени эндотелиальной дисфункции.

Общеизвестно, что «иммунный профиль» предопределяет явление полиморфизма генов цитокинов, и в своём провоспалительном варианте данный феномен обусловливает повышенную активность иммунной системы. Однако нельзя забывать о том, что АГ является заболеванием многофакторной природы, поэтому в этом случае знания «продукта» гена, его эффекта на функциональные свойства белка оказывается недостаточно, и многое зависит от индивидуальных особенностей и экзогенных условий [16][17]. По результатам проведённого нами анализа снижение метаболической резистентности эндотелия было ассоциировано с наличием полиморфизма «-174 G/C» в гене ИЛ-6 и «308 G/A» в гене ФНО-α. Таким образом, выполненные генетические исследования позволили выявить у пациентов с рефрактерной АГ высокую встречаемость явления полиморфизма генов, кодирующих «ранние» реакции воспалительного процесса и иммунного ответа. Это, безусловно, в дальнейшем способствует ограничению функционала эндотелиоцитов и прежде всего их вазодилататорного потенциала и метаболической резистентности.

1. У пациентов с рефрактерной АГ в 33,3% случаев выявляется снижение метаболической эндотелиальной резистентности и способности к ЭЗВ.

2. При рефрактерной АГ имеет место значимая разбалансировка между про- и противовоспалительными цитокинами в сторону первых.

3. Эндотелиальная дисфункция при рефрактерной АГ сопряжена с феноменом полиморфизма «-174 G/C» гена ИЛ-6 и «308 G/A» ген ФНО-α.