Цитокиновый профиль пациентов с кальцинозом коронарных артерий без ишемической болезни сердца

Введение

Кальциноз коронарных артерий, является одним из этапов развития атеросклероза, протекающий, как правило, синхронно с депозицией кальция в субинтимальном слое артерий [1]. Кальцификация интимы является активным процессом, ассоциированным с наличием факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, таких как старение, сахарный диабет, гиперлипидемия, местных факторов, которые стимулируют её образование [2]. Возникает данный патологический процесс в результате преципитации кальция, вызванной активностью хондроцитоподобных клеток, и воспалительным каскадом, активируемым макрофагами, моноцитами и локальным высвобождением различных цитокинов [3]. Кальцификация коронарных артерий представляет междисциплинарную проблему, которая влияет на исход лечения не только консервативного, но и хирургического. В связи с этим определение коронарного кальция является прогностическим маркером, для определения дальнейшей тактики ведения пациентов как при наличии предтестовой вероятности ИБС, так и при доказанной ИБС. Так, например, шкала SYNTAX II, позволяющая принять решение о методе реваскуляризации миокарда у пациентов с ИБС, коронарном стентировании или шунтировании, учитывающая коронарный кальциноз и сопутствующую патологию [4]. Однако данная шкала применяется непосредственно уже на стадии лечения значимого коронарного атеросклероза и не влияет на его вторичную профилактику. Важным в стратификации риска сердечно-сосудистых событий является не только оценка исхода активного атеросклероза, а именно кальциноза артерий, но и процессов, лежащих в основе его развития. В настоящее время одной из ведущий теорий атеросклероза признается ответ иммунной системы на повреждение, изучается и дополняется эта теория данными о клеточном, гуморальном иммунном ответе, цитокинах [5]. Однако работ, которые раскрывали бы те или иные звенья иммунного ответа у пациентов с коронарным кальцинозом, немного, и они носят противоречивый характер. При этом высказывается мнение о роли воспалительных цитокинов, инициирующих остеогенную дифференцировку и минерализацию сосудистой стенки, но не отражается одномоментное исследование противоспалительных цитокинов [6].

Цель исследования — изучение цитокинового профиля у пациентов с коронарным кальцинозом разной степени выраженности без клинических проявлений ИБС.

Материалы и методы

Исследование проводилось в ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России в рамках государственного задания Минздрава России. В исследование были включены пациенты с коронарным атеросклерозом без клинических проявлений ИБС, которым проведена мультиспиральная компьютерная томография, синхронизированная с ЭКГ, и рассчитан коронарный индекс (КИ) по методике Агатстона, где низкий риск — 0–10 ЕД., умеренный риск — 11–100 ЕД., высокий риск — 101–400 ЕД., очень высокий риск — ≥401 ЕД [7]. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом. В исследовании приняли участие 68 пациентов мужского пола, из них 25 человек с коронарным атерокальцинозом — соответствующие группе умеренного риска (I группа), 23 человека с коронарным атерокальцинозом — соответствующие группе высокого риска (II группа) и 20 респондентов группы контроля, у которых нет клинических и инструментальных признаков коронарного атеросклероза, по данным СКТ коронарных артерий, сопоставимых по возрасту (54,2±1,6; 55,9±1,2 и 53,7±1,2 соответственно, р мн.=0,36). Пациенты обеих групп имели факторы риска атеросклероза (артериальная гипертензия, дислипидемия), а вошедших во II группу отличал фактор  курения. Из фармакологического анамнеза: пациенты обеих групп не принимали гиполипидемические препараты. Критериями исключения были сахарный диабет, онкопатология, заболевания соединительной ткани, хронические вирусные инфекции. Всеми участниками исследования было подписано добровольное информированное согласие на участие и проведение необходимых исследований. С целью рандомизации групп была проведена спиральная компьютерная томография (СКТ) коронарных артерий и аорты (спиральный компьтерный томограф Revolution EVO, GE Healthcare) пациентам которым определены показания для этого исследования. Оценка коронарного кальция (КК) и расчёт индекса Агатстона проведены с помощью программного обеспечения для расчёта коронарного кальция Smart Score. Исследование цитокинов сыворотки крови (IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, FNO-α и IFN-γ) проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (анализатор «Униплан» АИФР-01, ЗАО «Пикон», РФ) с использованием тест-систем производства ООО «Цитокин», Санкт-Петербург, Россия. Липидный профиль оценивали с помощью анализатора Konelab Prime 60i, США и реагентов «Холестерин общий», «Холестерин ЛПНП», «Холестерин ЛПВП», «Набор реагентов для определения триглицеридов GPO-PAP», производство НПФ Абрис плюс, Россия. Расчет индекса атеросгенности осуществляли следующим способом ИА=(ОХС-ЛПВП)/ЛПВП. Статистический анализ результатов исследования проводили с применением программы Statistica 12.0 (StatSoft, США). Показатели в группах представлены средним выборочным значением (М) со стандартной ошибкой (m). Нормальность распределения значений в выборках проверяли по критерию Шапиро-Уилка. Для сравнения показателей в трёх группах использовали дисперсионный анализ и критерий Краскела-Уоллиса. При попарном сравнении вводили поправку на число сравниваемых групп по Тьюки.

Результаты

Известно, что кальциноз коронарных артерий взаимосвязан с дислипидемией и другими факторами риска атеросклероза. В таблице 1 представлен индекс коронарного кальция, измеренный в обеих группах наблюдения, где отмечено большее значение во II группе с умеренно повышенным риском развития ИБС. Не менее интересным представляется анализ липидного профиля, отражающего повышенные относительно целевых показателей значения проатерогенных липидов (ЛПНП, ТГ) и снижение ЛПВП. При этом значимых различий между I и IIгруппами не выявлено.

Анализируя противовоспалительный цитокиновый профиль групп с коронарным кальцинозом в сопоставлении с контрольной, мы отмечаем значимое повышение IL-4 в I группе, при этом во II группе намечена лишь тенденция к его повышению, различий в содержании данного цитокина между группами I и II  не выявлено (табл. 2). Содержание IL-10 в группе умеренного риска в 4 раза выше, чем в группе контроля, и в 2 раза выше, чем в группе высокого риска.

При сопоставительном анализе провоспалительного профиля не отмечено значимого отличия в содержании TNFα в обеих группах коронарного кальциноза и контрольной. Содержание IL-6 в сыворотке крови значимо выше в I и II группах по сравнению с контролем. Обращает внимание значительное повышение уровня IL-17 в обеих группах с коронарным кальцинозом, превышающее в 10 раз его содержание относительно группы контроля. Повышение более чем в 2 раза провоспалительного потенциала в обеих группах коронарного кальциноза подтверждает сывороточное содержании IFNγ (в сравнении с контролем).

Помимо констатации количественного содержания цитокинов, нами проведена оценка соотношения про- и противоспалительных цитокинов. На рисунке наглядно представлены показатели соотношения количественных параметров провоспалительных цитокинов IFNγ и IL-17 к содержанию противовоспалительных медиаторов, для отражения цитокинового баланса. В таблице 2 отражены значения уровня достоверности при сравнении с данными индексов в группах. Рассматривая в исследуемых группах соотношение IFNγ к IL-4 следует отметить значение более 1 как в контрольной, так и в группах с коронарным кальцинозом разной степени выраженности. Неоднозначны изменения IFNγ к IL-10, где значения больше 1 отмечены в группе контроля и II группе, при этом в I группе этот параметр менее 1. При оценке соотношения IL-17 к IL-4 и IL-10 в группе контроля выявлено преобладание противовоспалительной активности двух цитокинов. В группах с коронарным кальцинозом отмечено повышение провоспалительного потенциала за счёт уровня IL-17, причём чем более выражен коронарный кальциноз, тем больше этот индекс.

Таким образом, по результатам проведенного исследования можно отметить неоднозначное изменение цитокинового баланса у пациентов с коронарным кальцинозом.

Обсуждение

Роль различных цитокинов и их рецепторов в развитии атеросклероза на разных этапах, изучается длительное время, в том числе и в экспериментальных работах [8]. Известно, что для IL-4 характерна антиатерогенная роль, т.к., являясь медиатором Тh2, данный цитокин переключает иммунный ответ к синтезу антител с изотипа IgM на IgG к окисленным липопротеинам низкой плотности [9]. Данное положение отражено в работе Wang C. и соавт., где было показано, что уровень IL-4 значительно ниже в группе без ИБС [10]. В анализируемой литературе не найдены работы, изучающие циркулирующий в сыворотке крови IL-4 у пациентов с коронарным кальцинозом, отмечена лишь роль в эксперименте in vitro в подавлении синтеза остеопротегерина (фактор минерализации) гладкомышечными клетками коронарных артерий [11]. Таким образом, можно предположить, что, блокируя окисленные ЛПНП, принимающих прямое участие в воспалении при атеросклерозе и кальцинозе, повышенный уровень IL-4 в группе с меньшим уровнем индекса коронарного кальция свидетельствует о его защитной роли. Изучая роль противовоспалительного цитокина IL-10, мы отметили его значимое повышение в группах с коронарным кальцинозом, причем в I группе сывороточный уровень IL-10 был значимо выше, чем в группе с более выраженным кальцинозом. Полученные результаты сопоставимы с выводами крупномасштабного исследования MESA (Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis), где было отмечено большее содержание IL-10 у пациентов с индексом коронарного кальция более 0 ЕД [12]. Возможно, это связано с активацией Т-регуляторных лимфоцитов, основным продуктом синтеза которых является противовоспалительный цитокин - IL-10, и подавлением синтеза макрофагами остеопонтина (кальцифицирующего агента) [13]. В другом исследовании была показана прямая корреляционная связь IL-10 с повышением уровня TNFα и коронарным кальцинозом, что подтверждает супрессивную роль IL-10 [14]. Однако встречаются и противоречивые данные о том, что более высокие уровни IL-10 связаны с более низкой атеросклеротической нагрузкой на коронарные артерии, но не с общим объёмом коронарной кальцификации [15]. Данный факт может служить предметом научных исследований и дискуссий. Значения IL-6, IL-17 и IFNγ достоверно выше в обеих группах наблюдения по сравнению с контролем, при этом в группе с индексом коронарного кальция более 100 ЕД, отмечалась лишь тенденция к повышению по сравнению с I группой. Отсутствие разницы между I и II группами может свидетельствовать об отсутствии значимости в степени коронарного кальциноза и содержания провоспалительных цитокинов. Обращает на себя внимание сопоставимый уровень TNFα во всех исследуемых группах, что противоречит результатам работ других авторов, так как TNFα, являясь плейотропным цитокином, играет ключевую роль в сосудистой кальцификации, секретируется в основном макрофагами в ответ на такие факторы, как окисленный ЛПНП и повреждённый внеклеточный матрикс. В различных экспериментальных работах была продемонстрирована роль TNFα, который способствует остеобластической дифференцировке гладкомышечных клеток сосудов и фибробластов за счёт активации факторов транскрипции посредством циклического АМФ. Более того, известно, что остеопротегерин, являясь растворимым рецептором суперсемейства TNF-α, способствует кальцификации артерий, усиливает экспрессию целого ряда провоспалительных цитокинов [16]. Напротив, TNF-α не обнаруживается в нормальной сосудистой интиме и липидных полосках и не превышает нормальных значений в сыворотке крови, в связи с чем мы можем предположить, что в наших группах с коронарным кальцинозом имеет место начальный этап развития атеросклероза, что и обусловливает отсутствие клинических проявлений ИБС и, соответственно, повышение TNF-α, так как значительное количество работ отражает увеличение содержания этого цитокина именно у пациентов с острым коронарным синдромом и клинически манифестированными вариантами стабильной ИБС. Клинические данные показывают, что уровень сывороточного IL-6 повышен у пациентов с коронарной кальцификацией. Цитокин способствует остеогенной сосудистой кальцификации, вызывая дифференцировку гладких миоцитов в остеобластоподобные клетки [17] путём активации лиганда NF-κB – RANKL, запускающего синтез и экспрессию интерлейкина 1β, одного из ведущих цитокинов воспалительного процесса. Наши данные согласуются с результатами крупного метаанализа, где рассматривались 29 исследований с изучением зависимости уровня IL-6 и различных исходов коронарного атеросклероза, в том числе развитие коронарного кальциноза. Такие исследования, как CIRT (Cardiovascular Inflammation Reduction Trial), MESA, CANTOS (Canakinumab Anti-Inflammatory Thrombosis Outcomes Study) показали прямую зависимость высокого уровня IL-6 и коронарного кальциноза, где в том числе рецепторы IL-6 рассматривались как терапевтическая мишень различной тяжести атеросклероза [18]. Следующим многоликим цитокином является интерлейкин 17. Популяция Th17 лимфоцитов немногочисленна в области атеросклеротической бляшки, однако IL-17 может синтезироваться макрофагами М1, тучными клетками в зоне коронарного кальциноза [19]. Немногочисленные работы показывают повышение содержания данного цитокина у пациентов не только с острым коронарным синдромом, но и выраженным кальцинозом, что сопоставимо с результатами проведённого нами исследования. Роль IL-17 в кальцификации коронарных артерий опосредована через воздействие на провоспалительные и противовоспалительные цитокины, хемокины, матриксные металлопротеиназы, молекулы адгезии, реализующееся в синтезе коллагена гладкомышечными клетками коронарных артерий, с последующим развитием фиброза как промежуточного этапа кальциноза коронарных артерий [20]. Повышенные значения IL-17 также могут быть связаны с его эффектом переключения макрофагов М1 (провоспалительный фенотип), на макрофаги М2 (противовоспалительный фенотип) увеличивая синтез цитокинов IL-4 и IL-10, уровень которых повышен в изучаемых нами группах [3]. Не менее интересным представляется анализ содержания IFNγ, значительно превышающее уровень в группах с коронарным кальцинозом по сравнению с контролем. В публикуемых работах различных авторов отмечены аналогичные результаты. Возможно, это связано с тем, что, являясь основным эффекторным цитокином Th1 лимфоцитов, IFN-γ может способствовать привлечению провоспалительных клеток (макрофагов) и ускорять развитие коронарного кальциноза, активацию и выработку антител IgG2a В-клетками к окисленным ЛПНП, которые также являются ключевыми регуляторами кальцификации атеросклеротических поражений [21]. Другими авторами отмечено свойство IFN-γ, реализуемое в увеличении транскрипции генов, повышающих синтез остеопонтина — мощного фактора сосудистой кальцификации [22].

Подводя итог анализа содержания и роли про- и противоспалительных цитокинов у пациентов с коронарным кальцинозом, мы не считаем возможным сделать однозначный вывод. Однако оценка индексов соотношения основных провоспалительных цитокинов к противоспалительным отражает поляризацию цитокинового профиля у пациентов с коронарным кальцинозом по провоспалительному пути и сохранение противовоспалительного резерва у пациентов с менее выраженным кальцинозом коронарных артерий.

Заключение

Таким образом, в нашей работе продемонстрирована комплексная оценка цитокинового профиля у пациентов с различной степенью выраженности коронарного кальциноза без клинических проявлений ИБС, показывающая преобладание провоспалительного ответа в обеих группах, с сохранностью иммунорегуляторных процессов в группе с менее выраженным коронарным кальцинозом. Полученные данные не являются однозначными ввиду плейотропности эффектов цитокинов, что требует сопоставления результатов с одномоментным анализом потенциала иммунокомпетентных клеток, ответственных за их синтез.