Клинико-микробиотические корреляции при язвенном колите: бактериальные и грибковые таксоны при рецидиве и ремиссии заболевания

Введение

Язвенный колит (ЯК) — хроническое иммуновоспалительное заболевание, характеризующееся рецидивирующим течением и поражением слизистой оболочки (СО) толстой кишки [1][2]. Этиология ЯК окончательно не установлена; современные данные подтверждают гипотезу о многофакторности нарушений, опосредованных воздействием окружающей среды, генетики, микробиоты, а также активацией врождённых и адаптивных иммунных реакций [3–5]. В исследованиях последних лет особое внимание уделяется роли микробного сообщества в патогенезе ЯК: дисбиотические изменения ассоциированы с нарушением эпителиального барьера, повышением кишечной проницаемости и поддержанием хронического воспаления [6–8]. Бактериальный компонент кишечной флоры изучен наиболее подробно, вместе с тем грибковые представители (микобиота), несмотря на меньшую численность, являются функционально значимым элементом экосистемы толстой кишки [9][10].

Большинство имеющихся данных о таксономическом составе кишечной микробиоты при ЯК получено в кросс-секционных исследованиях, основанных на сравнении микробиотических профилей пациентов и здоровых лиц. Выявление микробных сигнатур рассматривается как одно из перспективных направлений разработки персонализированных подходов к ведению пациентов с ЯК, включая оценку активности заболевания и потенциального ответа на терапию. Описанные при ЯК дисбиотические паттерны включают снижение α-разнообразия и относительной представленности ряда комменсальных и обладающих предполагаемыми противовоспалительными свойствами бактерий — продуцентов короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), в том числе Akkermansia muciniphila, Ruminococcus flavefaciens, Alistipes massiliensis и Roseburia intestinalis, а также увеличение доли оппортунистических представителей, включая Escherichia/Shigella, Bacteroides spp., Streptococcus parasanguinis, Campylobacter spp., Salmonella spp., Granulicatella paradiacens и грибы родов Candida и Malassezia [11–13]. Однако одномоментное межиндивидуальное сравнение не позволяет оценить обратимость выявленных изменений и их связь с динамикой воспалительной активности. Кроме того, большинство исследований посвящено бактериальному компоненту микробиоты, тогда как грибковое сообщество и бактериально-грибковые взаимодействия в динамике заболевания изучены недостаточно. В связи с этим особый интерес представляет продольное наблюдение с повторным анализом биологических образцов у одних и тех же пациентов в фазах рецидива и ремиссии ЯК.

Цель исследования — изучить особенности структуры бактериального и грибкового сообществ толстой кишки у пациентов с ЯК в фазах рецидива и ремиссии и определить таксономические группы, имеющих достоверные ассоциации с клинической и эндоскопической активностью заболевания.

Материалы и методы

В исследование включали пациентов, соответствовавших следующим критериям: верифицированный диагноз «ЯК», лёгкая или среднетяжёлая атака заболевания, возраст старше 18 лет и наличие подписанного информированного согласия. Критериями исключения являлись тяжелая или сверхтяжелая атака ЯК, приём антибактериальных препаратов, а также пре-, про- или синбиотиков за последние 2 месяца, беременность и период грудного вскармливания, злокачественные новообразования в анамнезе или на момент включения и тяжёлая сопутствующая патология.

Исходную клиническую когорту составили 86 пациентов с ЯК в фазе рецидива, которым проводили 12-недельную индукционную медикаментозную терапию в соответствии с действующими клиническими рекомендациями Российской гастроэнтерологической ассоциации и Ассоциации колопроктологов России по диагностике и лечению ЯК [5]. Активность заболевания оценивали на основании клинических данных (анамнез, жалобы и результаты физикального обследования), лабораторных показателей (общий и биохимический анализы крови, уровень фекального кальпротектина (ФК)) и инструментальных методов исследований (видеоилеоколоноскопия с биопсией СО и последующей гистологической верификацией). Через 12 недель клинико-эндоскопическая ремиссия была достигнута у 42 из 86 пациентов (48,8%). Эта подгруппа была сформирована внутри исходной клинической когорты и рассматривалась как группа сравнения.

Средний возраст пациентов, достигших клинико-эндоскопической ремиссии, составил 38,0±4,4 года, а пациентов исходной когорты в фазе рецидива — 32,03±5,5 года. Среди пациентов, достигших ремиссии, было 19 мужчин и 23 женщины (45,2% и 54,8% соответственно), в исходной когорте в фазе рецидива — 42 мужчины и 44 женщины (48,9% и 51,1% соответственно).

На втором этапе исследования определяли таксономический профиль микробиоты толстой кишки в фазах рецидива и ремиссии ЯК методом ампликонного секвенирования генов 16S и 18S рРНК образцов кала. Пациентов и биологические образцы для молекулярно-генетического анализа отбирали методом простой случайной выборки с использованием генератора случайных чисел. В анализ включили образцы 41 пациента с рецидивом ЯК (47,7% исходной когорты; n = 86) и 24 пациентов, достигших клинико-эндоскопической ремиссии (57,1% числа пациентов с достигнутой ремиссией; n = 42).

Статистическую обработку данных выполняли с использованием программ IBM SPSS Statistics 26, Jamovi 2.3.24 и JASP 0.95.1.0. Нормальность распределения количественных переменных оценивали с помощью критерия Шапиро — Уилка и критерия Колмогорова — Смирнова с поправкой Лиллиефорса. Для межгруппового сравнения количественных показателей применяли U-критерий Манна — Уитни; при распределении признаков, подчиняющихся нормальному распределению, использовали t-критерий Стьюдента. Связи между относительной представленностью бактериальных и грибковых таксонов, клинико-лабораторными показателями и индексами активности ЯК оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rₛ). В анализ включали клинический индекс SCCAI (Simple Clinical Colitis Activity Index), эндоскопический индекс UCEIS (Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity), индекс Мейо, эндоскопический индекс Schroeder, уровень ФК (мкг/г), С-реактивного белка (СРБ, мг/л), скорость оседания эритроцитов (СОЭ, мм/ч) и количество лейкоцитов периферической крови (×10⁹/л). Силу связи оценивали по абсолютному значению коэффициента |rₛ|: 0,00–0,19 — очень слабая, 0,20–0,39 — слабая, 0,40–0,59 — умеренная, 0,60–0,79 — высокая, 0,80–1,00 — очень высокая [14].

Результаты

В исходной когорте пациентов с рецидивом ЯК среднетяжёлая атака была зарегистрирована у 52 (60,5%), лёгкая — у 34 (39,5%) пациентов. Часто рецидивирующее течение отмечено у 52 (60,5%) пациентов, в том числе у 14 из 34 пациентов с лёгкой атакой (41,2%) и у 38 из 52 пациентов со среднетяжёлой атакой (73,1%). Редко рецидивирующее течение выявлено у 34 (39,5%) пациентов: у 20 (58,8%) с лёгкой и у 14 (26,9%) со среднетяжёлой атакой. При легкой атаке чаще диагностировали левосторонний колит (E2) — 21 случай (61,8%), тогда как при среднетяжёлой атаке преобладал тотальный колит (E3) — 33 случая (63,5%). В общей группе левосторонний колит выявлен у 40 (46,5%), тотальный — у 46 (53,5%) пациентов. Значения клинических и эндоскопических индексов были выше у пациентов со среднетяжёлой атакой ЯК (табл. 1).

По результатам 16S-секвенирования, в образцах пациентов с ЯК идентифицированы представители 18 бактериальных типов, 282 родов и 273 видов. Доминировали типы Bacillota (ранее Firmicutes), Bacteroidota (ранее Bacteroidetes), Actinomycetota (ранее Actinobacteria) и Pseudomonadota (ранее Proteobacteria) — типичные представители бактериальной флоры толстой кишки, обнаруженные в образцах всех обследованных пациентов. В фазе рецидива среди доминирующих таксонов отмечались комменсальные бактерии, характерные для «здорового» микробиоценоза — роды Bacteroides, Faecalibacterium, Prevotella, Alistipes, Bifidobacterium, UCG-002, Subdoligranulum и Ruminococcus, а также виды Faecalibacterium prausnitzii, Bacteroides uniformis, Bacteroides dorei и Akkermansia muciniphila. Наряду с ними выявлялись потенциально «провоспалительные» и оппортунистические таксоны, включая род Collinsella и виды Bacteroides vulgatus, Prevotella copri и Collinsella aerofaciens. Доминирующая микробиота толстой кишки в стадии ремиссии ЯК имела схожий бактериальный профиль, наблюдаемый при рецидиве, и включала как «противовоспалительные» таксоны (Bacteroides dorei, Bacteroides uniformis, Faecalibacterium prausnitzii, Alistipes, Bifidobacterium, UCG-002, Subdoligranulum, Ruminococcus), так и бактерии, ассоциированные с ВЗК (Collinsella aerofaciens, Bacteroides vulgatus).

Сравнительный анализ таксономического состава микробиоты пациентов в разные фазы течения заболевания продемонстрировал обилие условно-патогенных таксонов при рецидиве ЯК: среди родов достоверно преобладали Enterococcus, Streptococcus, Granulicatella, Actinomyces, Corynebacterium и др. (р=0,003–0,035), среди видов — Enterococcus spp. (р=0,008) и Escherichia/Shigella coli (р=0,04). Ремиссия, напротив, ассоциировалась с увеличением доли КЦЖК-продуцирующих и симбиотических бактерий — родов NK4A214 group, Pseudoscardovia, Anaerofilum, Candidatus Soleaferrea и др. (р=0,009–0,048), а также видов Roseburia inulinivorans (р=0,04), Ruminococcus callidus (р=0,042) и Ruminococcus bicirculans (р=0,004).

С помощью секвенирования 18S рРНК идентифицированы 15 родов и 28 видов эукариот в образцах пациентов с ЯК. Доминирующими грибковыми микроорганизмами у пациентов с ЯК в обеих группах зарегистрированы дрожжи Candida, Saccharomyces и Malassezia, являющиеся типовыми представителями комменсальной толстокишечной флоры [15], а также одноклеточные простейшие — Blastocystis, в частности вид Blastocystis hominis.

С целью оценки характера взаимосвязей между количественной представленностью бактерий и грибов в составе толстокишечной микробиоты и показателями активности ЯК был выполнен корреляционный анализ. Для пациентов с ЯК была выявлена прямая статистически значимая связь между оппортунистическими представителями Actinomyces, Corynebacterium, Bradyrhizobium, Enterococcus spp. и исследуемыми показателями: индексом активности SCCAI, эндоскопическим индексом UCEIS, индексами Мейо и Schroeder, уровнем ФК, СРБ, СОЭ и количеством лейкоцитов периферической крови (rₛ = 0,433–0,742, р<0,05). Увеличение индекса SCCAI было ассоциировано с ростом доли условно-патогенных Escherichia/Shigella coli (r_s=0,458–0,495, р<0,05); для оппортунистических видов Enterobacter spp. (aerogenes/asburiae/bugandensis/cancerogenus/cloacae/hormaechei/ludwigii/mori/roggenkampii/soli/tabaci — высокая генетическая близость ограничивает возможность их дифференциальной идентификации) зарегистрирована прямая связь с индексом Мейо, шкалой Schroeder и уровнем ФК (r_s=0,458–0,485, р<0,05; r_s=0,470–0,592, р<0,05).

Снижение КЦЖК-продуцентов Alistipes и Lachnospiraceae NK4A136 group было ассоциировано с ростом индексов UCEIS, Мейо, Schroeder, а также увеличением СРБ (r_s=-0,461–-0,639, р<0,05). Комменсальные пробиотические виды Bifidobacterium adolescentis/faecale/stercoris продемонстрировали обратную корреляционную связь с индексом SCCAI (r_s=-0,442, р=0,045), а виды Bifidobacterium catenulatum/kashiwanohense/pseudocatenulatum – с уровнем ФК (r_s =-0,485, р=0,026). Рост бутират-продуцирующего вида Ruminococcus bicirculans сопровождался снижением всех анализируемых клинико-лабораторных показателей и индексов активности ЯК (r_s=-0,593– -0,701, р<0,05).

Повышение относительной численности рода Candida и вида Candida wounanorum коррелировало с увеличением исследуемых параметров — индексов SCCAI, UCEIS, Мейо, Schroeder, ФК, СРБ, СОЭ и количеством лейкоцитов, — однако эта связь не достигла статистической значимости (р>0,05). Обратную корреляционную связь с индексами активности и ФК продемонстрировал род Saccharomyces (r_s=-0,238–-0,375, р<0,05); также обратные корреляции с клиническими индексами, уровнем СРБ, СОЭ и количеством лейкоцитов выявлены для Cryptococcus vishniacii (r_s=-0,443–-0,565, р<0,05) и для рода Malassezia — с индексом SCCAI и СОЭ (r_s=-0,463–-0,488, р<0,05).

Обсуждение

Межгрупповой таксономический анализ выявил различия структуры бактериальной микробиоты толстой кишки в зависимости от фазы ЯК. Фаза рецидива характеризовалась преобладанием ряда условно-патогенных и оппортунистических бактерий, тогда как в фазе ремиссии чаще выявлялось увеличение доли потенциальных продуцентов КЦЖК и симбиотических микроорганизмов. Эукариотический компонент микробиоты в обеих фазах включал грибы родов Candida, Malassezia и Saccharomyces. Отдельного внимания заслуживает обнаружение негрибкового микробного эукариота Blastocystis hominis. Полученные данные согласуются с представлениями о неоднозначной роли Blastocystis spp. в кишечной экосистеме и возможной зависимости его эффектов от подтипа и клинического контекста [16–18].

Корреляционный анализ выявил статистически значимые ассоциации между относительным содержанием отдельных бактериальных и грибковых таксонов, клинико-лабораторными показателями и индексами активности ЯК. Для условно патогенных и оппортунистических представителей — Actinomyces spp., Corynebacterium spp., Enterococcus spp., Enterobacter spp., Bradyrhizobium и Escherichia/Shigella — установлены преимущественно прямые корреляции, тогда как для КЦЖК-продуцентов и «противовоспалительных» микроорганизмов — Alistipes spp., Bifidobacterium spp., Lachnospiraceae NK4A136 group и Ruminococcus bicirculans — обратные. Грибковые таксоны Saccharomyces, Malassezia и Cryptococcus vishniacii также демонстрировали обратные ассоциации с отдельными исследуемыми показателями.

Заключение

Несмотря на прогресс в терапии ЯК, у части пациентов сохраняются недостаточный ответ на лечение и потребность в более точных методах мониторинга активности заболевания. В настоящем исследовании было выявлено, что клинико-лабораторные показатели и эндоскопические индексы закономерно сопровождаются соответствующими изменениями относительной представленности ряда таксонов бактерий и грибов, отражая клиническую динамику на фоне курсовой терапии. Полученные результаты позволяют рассматривать отдельные компоненты микробиоты как потенциальные маркеры тяжести воспаления при ЯК.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.