Некоторые итоги пилотного исследования мутаций в генах ASXL1 и DNMT3A при миелодиспластическом синдроме

Введение

Мутации эпигенетических регуляторов c.1934dupG в гене ASXL1 (мутация c.1934dupG) и R882H в гене DNMT3A (мутация R882H) при миелодиспластическом синдроме (МДС) являются ассоциированными с плохим прогнозом общей 5-тилетней выживаемости, а также повышают риск трансформации МДС в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) [1–3].

Мета-анализ Yun Lin и соавт., охватывающий 1689 пациентов, установил следующие данные МДС при разных мутациях в гене ASXL1 [4]:

1. Различие в общей выживаемости пациентов обусловлено не наличием мутаций в гене ASXL1, а коморбидностью и местом проживания.
2. Мутации в гене ASXL1 чаще встречались у мужчин в старческом возрасте и у пациентов со сравнительно низким уровнем тромбоцитов или гемоглобина.

Подобные исследования помогают анализировать влияние мутаций в гене ASXL1 при МДС, но их главным ограничением является отсутствие анализа доминирующей мутации. То есть анализу при помощи технологий секвенирования подвергаются разные мутации гена ASXL1, в то время как в клинической практике на сегодня невозможно проводить подобные молекулярно-генетические исследования всем пациентам с МДС. При этом наиболее частые мутации ASXL1 обнаружены в экзоне 12, а самой распространённой из них является дублирование гуанина в положении 1934 в области 8G-гомополимера (обозначается как «c.1934dupG; p.Gly646fs») [5–7]. Мутация c.1934dupG является самой частой в ASXL1 согласно базе данных Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC) и исследованию Wang L. и соавт., включающему 6043 пациентов с гематологическими новообразованиями [8].

Мутация R882H является одной из наиболее распространённых при гемобластозах взрослых [9][10], есть данные о её негативной роли в патогенезе МДС [11]. Но на сегодня до конца не исследованы особенности клинического течения МДС при наличии мутации c.1934dupG и/или мутации R882H. Например, нет данных о зависимости этих генетических нарушений с группами риска по числовым прогностическим шкалам МДС (IPSS-R, WPSS) [12][13], фиброзом костного мозга, экспрессией CD34+, CD13/CD16, трансфузионной зависимостью и коморбидностью. Но именно такие клинические характеристики МДС достоверно предопределяют не только прогноз выживаемости или риск трансформации в ОМЛ, но и качество жизни пациента.

Цель исследования  — определить распространённость мутации c.1934dupG и мутации R882H при МДС и их влияние на значимые клинические характеристики.

Материалы и методы

В исследование были включены 33 мужчины и 17 женщин с медианным возрастом 57 лет (18–83) и верифицированным диагнозом МДС, поступившие на лечение с сентября 2019 г. по июнь 2022 г. в ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России и МБУЗ «Городская больница №7 г. Ростова-на-Дону». В качестве контроля были взяты 22 добровольца без гематологической патологии (8 мужчин, 14 женщин от 22 до 65 лет).

Научная работа одобрена Локальным независимым этическим комитетом на базе ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России (протокол №14/20 от 21.09.2020).

Участники исследования проживали в Южном федеральном округе (Ростовская область, Краснодарский край, Республика Крым) и Северо-Кавказском федеральном округе (Ставропольский край, Кабардино-Балкарская Республика, Республика Дагестан, Республика Ингушетия, Чеченская Республика, Карачаево-Черкесская Республика). Все пациенты получали диагностику и лечение в соответствии с актуальными клиническими рекомендациями и действующими стандартами оказания медицинской помощи больным с МДС (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 14 ноября 2007 г. № 704).

Пациенты на момент включения в исследование либо уже имели верифицированный диагноз МДС (n=11), либо это был впервые выявленный случай (n=39). Критерием для включения пациента в исследование был проведённый объём диагностических исследований, позволяющий определить вариант МДС — общий клинический анализ крови в гематологическом анализаторе с визуальным подсчётом форменных элементов крови, миелограмма с подсчётом бластов костного мозга и оценкой дисплазии, цитогенетическое исследование клеток костного мозга по выявлению изолированной аномалий кариотипа в виде утраты участка длинного плеча хромосомы 5 (5q). Также было обязательно соблюдение минимальных диагностических критериев МДС: цитопения при стойком снижении гематологических показателей ниже пороговых значений: гемоглобин крови менее 100 г/л; абсолютное число нейтрофилов менее 1,8×10⁹ /л и/или тромбоцитов менее 100×10⁹/л.

Источником клинических данных послужили данные из историй болезней (табл. 1). Все использованные в исследовании результаты лабораторных анализов проводились пациентам на 1–2-е сутки пребывания на стационарном лечении.

Были определены нозологические варианты МДС согласно классификации ВОЗ от 2017 года (табл. 2).

В исследование были включены оценки по прогностическим шкалам IPSS-R, WPSS и MDS-CI (шкала коморбидности для больных МДС) [14] (табл. 3), которые позволяют определить индивидуальный прогноз выживаемости и трансформации МДС в ОМЛ.

За период наблюдения за пациентами (34 месяца) было зарегистрировано 10 летальных исходов и 15 случаев трансформации в ОМЛ.

У всех участников исследования был произведён забор крови в вакуумные пробирки с ЭДТА-К3 объёма 9 мл. Забор крови у пациентов производился на 1–4-е сутки пребывания на стационарном лечении. Далее вакуумные пробирки с венозной кровью в течение 1 часа помещались на хранение в низкотемпературную морозильную камеру UF V 700 (Binder, Германия) при температуре от -72 до -76 ℃ или сразу отправлялись на процедуру выделения ДНК.

Выделение ДНК из образцов клеток периферической крови проводили с помощью наборов «ДНК-ЭКСТРАН-1» (Синтол, Россия) и ExtractDNA Blood&Cells (Евроген, Россия) по протоколам производителей.

Было проведено ПЦР-исследование всех образцов ДНК по детекции мутации c.1934dupG и мутации R882H с помощью адаптированных и доработанных способов анализа эффективности амплификации и рестрикционного анализа с референсным секвенированием по Сенгеру (табл. 4). Секвенирование проводилось в научной лаборатории «Идентификация объектов биологического происхождения» Академии биологии и биотехнологии Южного федерального университета.

Анализ выживаемости производился методом Каплан-Майер. Производился расчёт относительного риска (ОР), хи-квадрат и корреляции Пирсона. Значимыми считались различия на уровне p<0,05. Статистическая обработка данных проводилась c применением пакета программ Graphpad Prism, а также в пакетах Survival и Survminer (для языка программирования R v. 4.2.1).

Результаты

Мутация R882H не была обнаружена в исследуемых образцах. Мутация c.1934dupG не была обнаружена у лиц без гематологической патологии. Из-за низкой концентрации выделенной ДНК из клеток венозной крови (<5 нг/мкл), не удалось произвести ПЦР-исследование у 7 пациентов (табл. 5).

Для оценки разработанного диагностического теста по идентификации мутации c.1934dupG был произведён расчёт чувствительности и специфичности (табл. 6).

Мутация c.1934dupG обнаружена у 28 мужчин и 8 женщин (хи-квадрат — 4,760; p=0,03). Медиана возраста пациентов без мутации 56 лет (18-82), а с мутацией — 56,5 (32–81).

Анализ распределения мутации c.1934dupG по группам риска шкал IPSS-R, WPSS, MDS-CI показал, что она обнаруживается во всех группах (табл. 7).

Были построены корреляционные матрицы по методу Спирмена, включающие в себя номинативные показатели (гемоглобин крови <80 г/л, наличие бластов в периферической крови, бластоз костного мозга ≥5%, наличие мутации c.1934dupG, фиброз костного мозга, трансфузионная зависимость, лактатдегидрогеназа в сыворотке крови >450 Ед/л, экспрессия CD34+ и CD13/CD16) и количественные показатели (возраст). Корреляционные матрицы представлены на рисунке 1.

Для мутации c.1934dupG наблюдается слабая отрицательная корреляция с экспрессией CD34+ и возрастом; сильная положительная корреляция наблюдается между экспрессией CD34+ и бластозом костного мозга ≥5%, фиброзом костного мозга и экспрессией CD13/CD16, бластозом костного мозга ≥5% и наличием бластов в периферической крови.

Анализ общей выживаемости в зависимости от наличия и отсутствия мутации c.1934dupG (рис. 2), показал, что выживаемость между группами пациентов не различается (p=0,92). Доля летальных случаев с наличием мутации c.1934dupG составила 17±7%, без мутации — 27±11% (ОР 0,821, 95% ДИ 0,438–1540).

OР трансфузионной зависимости при наличии мутации c.1934dupG составил 2,844 (95% ДИ 0,502–16,098, p>0,05), а трансформации в ОМЛ — 1,467 (95% ДИ 0,351–6,131, p>0,05).

Для подтверждения отсутствия мутации R882H 5 случайных образцов из выборки были секвенированы по Сэнгеру (выровненные с помощью программы BioEdit нуклеотидные последовательности области рядом с мутацией показаны на рисунке 3). В результате ни один из ампликонов не продемонстрировал наличие мутации, что подтверждает данные, полученные при использовании рестрикционного анализа.

Для подтверждения наличия или отсутствия мутации c.1934dupG 2 случайных образца из выборки (9 и 16, оба образца продемонстрировали наличие мутации по результатам анализа эффективности амплификации) были секвенированы по Сэнгеру. Хроматограммы секвенирования представлены на рисунке 4. В результате оба ампликона продемонстрировали наличие пика, свидетельствующего о низкокопийной мутации c.1934dupG.

Обсуждение

Мутация R882H не была обнаружена во всех исследуемых группах. Такой результат может быть обусловлен несколькими факторами (ограниченная выборка, этнографические особенности участников, наличие или отсутствие мутации в разные временные периоды МДС, ложноотрицательными результатами детекции). Недостаточный объём выборки, видимо, сыграл наибольшую роль в неуспешной детекции мутации R882H.

Исследование наличия мутации c.1934dupG при МДС впервые интерпретировано с применением рутинного ПЦР-исследования. Данный способ позволяет совершить оптимизацию молекулярно-генетической диагностики, заменив технологии секвенирования в клинической практике. Разработанный способ по детекции мутации c.1934dupG идентифицировал её в 56±7% случаев МДС с наибольшей вероятностью у пациентов с избытком бластов I типа (75±15,31%).

У способов детекции мутаций c.1934dupG и R882H было выявлено общее ограничение. Из-за лейкопении (число лейкоцитов ≤2,81×10⁹/л) не представилось возможным получить достаточную концентрацию ДНК (≥5 нг/мкл) для дальнейшего проведения анализа эффективности амплификации или рестрикционного анализа.

Полученные данные детекции свидетельствуют о том, что мутация c.1934dupG может быть обнаружена не только в разных вариантах МДС, но и в разных группах риска численных прогностических шкал WPSS, IPSS-R и MDS-CI. Можно предположить, что мутация c.1934dupG нетождественно интерпретируется существующими численными прогностическими шкалами МДС с точки зрения установленного при помощи них значения риска.

Общая выживаемость не различалась в зависимости от наличия и отсутствия мутации c.1934dupG. Не было обнаружено, что мутация c.1934dupG повышает риск трансфузионной зависимости или трансформации МДС в ОМЛ, которые являются важными факторами для прогноза клинического течения и качества жизни пациентов. Схожие результаты продемонстрированы корреляционным анализом, где наличие у пациентов мутации c.1934dupG было статистически независимо от наличия фиброза костного мозга, бластов в периферической крови, высокой степени бластоза костного мозга, высоким уровнем лактатдегидрогеназы и экспрессией CD34+, CD13/CD16.

Таким образом, в пилотном исследовании не подтверждены данные, что мутация c.1934dupG повышает риск тяжёлого течения МДС. При этом клиническая интерпретация мутации R882H осталась невозможной, что ограничивает перспективу дальнейшего изучения этой мутации при МДС и ставит задачу поиска других значимых соматических мутаций или включением в исследования большего числа респондентов.

Выводы

Исследование показало, что разработанный способ по детекции мутации c.1934dupG в клетках венозной крови позволяет совершить оптимизацию молекулярно-генетической диагностики. Ограничением для проведения адаптированных анализов эффективности амплификации и рестрикционного анализа являлась степень лейкопении крови. Не было обнаружено влияния мутации c.1934dupG на клиническое течение МДС при сравнении некоторых твёрдых и суррогатных конечных точек исследования.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.