Оценка маркеров апоптотических процессов и пероксидного окисления липидов митохондриальной фракции печени животных-носителей эпидермоидной карциномы Lewis на разных стадиях развития опухолевого процесса при введении оловоорганических соединений с протекторным фрагментом

Введение

Злокачественные новообразования по-прежнему остаются одной из основных причин смертности в мире, что определяет необходимость поиска альтернативных терапевтических стратегий для разработки новых противоопухолевых лекарственных средств. Одной из важных терапевтических мишеней являются субклеточные единицы митохондрии. Митохондрии необходимы для роста и прогрессирования опухоли. Сбалансированные процессы динамического равновесия метаболизма митохондрий координируют форму, размер, количество митохондрий, энергетический метаболизм, клеточный цикл, митофагию и апоптоз [1]. Высокая потребность в митохондриальной активности при злокачественных новообразованиях приводит к увеличению продукции митохондриальных активных форм кислорода (mtROS), накоплению мутаций в митохондриальной ДНК и развитию митохондриальной дисфункции [2]. Доказано, что митохондриальная дисфункция способствует агрессивности рака, метастазированию и резистентности к терапии [3]. Таким образом данный процесс может быть предложен в качестве потенциальной терапевтической мишени для лечения злокачественных новообразований. 

В последнее время большое число соединений, изучаемых на доклиническом этапе в качестве кандидатов в лекарственные средства, исследованы на предмет влияния на митохондриальный метаболизм на различных модельных системах in vitro и in vivo.

Например, матаирезинол, относящийся к группе лигнанов, запускает апоптоз и вызывает митохондриальные нарушения в репрезентативных клеточных линиях рака поджелудочной железы человека (MIA PaCa-2 и PANC-1), о чём свидетельствуют деполяризация митохондриальной мембраны, изменение содержания кальция и подавление клеточной миграции и связанных с ней внутриклеточных сигнальных путей [4]. Ингибирование митохондриальной функции анизомицином эффективно против тройного негативного рака молочной железы (TNBC) и происходит по механизму индукции каспазозависимого апоптоза, ингибирования митохондриального дыхания и снижения потенциала митохондриальной мембраны и уровня аденозинтрифосфата (АТФ) [5]. Пикеатаннол, природное фенольное соединение растительного происхождения (стильбеноид), обладает широким спектром биологической активности  — антипролиферативной, антиоксидантной, противовоспалительной и проапоптотической, что показано в различных исследованиях рака человека in vitro и in vivo с доказанным нарушением работы митохондрий [6].

Оловоорганические соединения широко изучаются в настоящее время как перспективные кандидаты в противоопухолевые лекарственные средства [7][8]. В проведённых нами ранее исследованиях доказано, что развитие векторного направления активности при влиянии гибридных оловоорганических соединений на про/антиоксидантное состояние клетки и апоптотический потенциал митохондрий зависит от соотношения оловосодержащих и антиоксидантных фрагментов и вводимой дозы [9][10]. Изменение состояния митохондрий под влиянием лидерных гибридных оловоорганических соединений в зависимости от степени развития опухолевого процесса требует дополнительного изучения.

Цель исследования — оценка маркеров апоптотических процессов и ПОЛ по накоплению МДА митохондриальной фракции печени животных-носителей эпидермоидной карциномы Lewis на разных стадиях развития опухолевого процесса при введении бис-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)тиолат диметилолова (Ме-3) и (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)тиолат трифенилолова (Ме-5).

Материалы и методы

Работа выполнена с использованием лабораторных животных (мыши-самки линии C57Bl/6). Животные получены из питомника НИЦ «Курчатовский институт» («ПЛЖ «Рапполово»). Все особи прошли карантинное изолирование в течение 14 суток. После истечения срока изоляции животные были осмотрены на отсутствие внешних признаков заболеваний, стандартизированы по полу, возрасту и весу и рандомизированы с помощью таблицы случайных чисел. Исследование одобрено локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «РостГМУ» Минздрава России (протокол №.10/20 от 28.05.2020).

Штамм эпидермоидной карциномы Lewis (LLC) мышей получен из банка опухолевых материалов Научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Для поддержания штамма инокулировали в мышцу бедра по 0,3 мл измельченных фрагментов опуxолевой ткани LLC в физиологическом pаcтвоpе xлоpида натpия, а перевивку опухоли опытным животным производили тем же количеством инокулума, но подкожно в правую подмышечную область [11, 12, 13]. Через 48 часов после перевивки соединения Ме-3 и Ме-5 вводили 1 раз в сутки в течение 5 дней внутрибрюшинно в максимально-эффективной дозе 375 мг/кг и 250 мг/кг соответственно. Животным контрольной группы вводили носитель в аналогичных режимах и объёмах. Количество особей во всех группах было одинаковым (n=12). Животных выводили из эксперимента на 7-е и 21-е сутки развития опухолевого процесса. Из ткани печени были выделены митохондрии по классической методике [14]. В митохондриальных образцах с помощью тест-систем методом ИФА определяли концентрацию цитохрома С (нг/г белка), каспазы–9 (нг/г белка), 8–гидрокси–2'–дезоксигуанозина (8–OHdG) (нг/г белка), МДА (нМ/г белка), а количество белка (мг/мл)  — биуретовым методом.

Для анализа всех первичных результатов применяли описательную статистику. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета компьютерных программ версии «Statistica 6.0». Нормальность распределения оценивали с помощью модифицированной версии метода Колмогорова-Смирнова, а именно по методике Андерсона-Дарлинга. В качестве количественной характеристики показателей в работе проанализированы среднее арифметическое и среднеквадратическое отклонение (M±m), а также изменение показателя в процентах. Сравнение групп производили попарно.

Субстанции гибридных оловоорганических соединений: ((3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилтиолат) трифенилолова (Ме-5) и бис(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенилтиолат) диметилолова (Ме-3), содержащих антиоксидантный фрагмент 2,6-ди-трет-бутилфенола, синтезированы в МГУ имени М.В.Ломоносова и предоставлены для исследований.

Результаты

Результаты изменения показателей апоптотических процессов и содержания МДА в митохондриальной фракции печени животных-носителей эпидермоидной карциномы Lewis при введении Ме-3 и Ме-5 приведены на рисунках 1 и 2. На 7-е сутки развития опухолевого процесса в печени, напрямую не задействованной в его росте, отмечено увеличение всех показателей, косвенно свидетельствующих о активации продукции активных форм кислорода, возрастании повреждения митохондриальной ДНК и активации проапоптотического маркера (каспаза-9), что в свою очередь указывает на активацию митохондриального звена апоптоза.

При дальнейшем развитии опухолевого процесса (21-е сутки) повышение показателей сохраняется по сравнению с интактной группой, но отмечено снижение по сравнению с предыдущим этапом развития процесса.

При введении Ме-3 в максимально эффективной дозе на 7-е и 21-е сутки отмечено снижение уровня всех исследуемых показателей, что позволяет доказать высокую актиоксидантную активность гибридного оловоорганического соединения (Ме-3), содержащего один оловосодержащий и два протекторных антиоксидантных фрагмента.

Следует отметить, что соединение Ме-5 обладает более  выраженным прооксидантным потенциалом в сравнении с Ме-3, о чём свидетельсвует более высокий уровень повреждения митохондриальной ДНК. Таким образом, оба соединения проявляют свойства антиоксидантов, но соединение с двумя фенольными группами является более активным антиоксидантом.

Обсуждение

Печень является основным метаболическим органом, регулирующим энергетический обмен всего организма, включая метаболизм глюкозы, жирных кислот и аминокислот, и играет центральную роль в гомеостазе питательных веществ [15]. Основываясь на количестве и плотности митохондрий в печени, метаболические пути в митохондриях, включая β-окисление, цикл трикарбоновых кислот, кетогенез, дыхательную активность и синтез АТФ посредством окислительного фосфорилирования, могут изменяться при физиологических и патологические состояния, включая рак [16].

Амфифильная структура противоопухолевых агентов способствует его накоплению в митохондриях раковых клеток [17], что вызывает накопление окислительных нуклеиновых кислот в цитоплазме [18]. Опухолевая агрессия увеличивает продукцию митохондриальных АФК, ПОЛ, снижая потенциал митохондриальной мембраны [19]. Митохондриальный путь был запущен путём повышения экспрессии белка каспазы 9, более выраженный при влиянии Ме-5. В клетках, подвергающихся апоптозу, высвобождение цитохрома С из митохондрий в цитоплазму и активация каспазы-9, ключевого фермента для стадии апоптотического пути, используются в качестве биомаркеров клеточной гибели (апоптоза) [20][21].

Механизмы реализации противоопухолевого и антиметастатического действия лидерных гибридных органических производных олова [22] на модели солидного роста эпидермоидной карциномы Lewis связаны с изменением активности про/антиоксидантного состояния и запуска апоптотических процессов в клетках печени, напрямую не связанных с опухолевым процессом.

Заключение

При введении соединений бис-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)тиолат диметилолова (Ме-3) и (3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)тиолат трифенилолова (Ме-5) выявлено изменение активности про/антиоксидантного состояния и запуска апоптотических процессов в клетках печени, что требует дальнейшей химической модификации тестируемых соединений с повышением уровня их селективности по отношению к опухолевой и условно здоровой клетке.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.