Типирование антигенов HLA-A, -B и гена DRB1 в клинической практике у пациентов Ростовской популяции для ранней диагностики ревматоидного артрита

Введение

Ревматоидный артрит — ревматическое заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся развитием хронического эрозивного артрита (синовиита) и системным воспалительным поражением внутренних органов. Непрерывно персистирующее течение РА приводит к нарушению функции суставов и является причиной инвалидизации пациента.

РА регистрируется у 0,5–1% взрослого населения (возраст — 35–55 лет) в популяциях всего мира и в разных этнических группах [1]. В гериатрических группах пациентов его распространение достигает 2% [2].

Скрининг РА не проводится. Но иммунологические нарушения титров ревматоидного фактора (РФ), АЦЦП и С-реактивного белка (СРБ) выявляют за несколько месяцев или лет до развития клинических симптомов РА. При этом определение содержания РФ входит в классификационные критерии анализа РА.

В качестве первичных лабораторных тестов в диагностике РА, кроме РФ, рекомендуется определение АЦЦП. Установлено, что АЦЦП по сравнению с РФ обладает более высокой специфичностью. Определение АЦЦП — важный и существенный шаг в диагностике раннего РА. Так, исследования НИИР РАМН показали, что у серопозитивных по АЦЦП пациентов с высокой степенью достоверности через 12 месяцев РА развился у 70%, а у серонегативных — по АЦЦП у 30% [1].

АЦЦП могут определяться у пациентов, находящихся в группе риска по РА ещё до развития клинических проявлений и рассматриваться как возможный предиктор заболевания [3].

Этиология развития заболевания РА пока полностью не установлена, но генетическая предрасположенность к развитию РА подтверждена.

Доказательством значительной роли наследственных факторов является анализ развития заболевания у монозиготных близнецов, у которых конкордантность развития РА составляет 12–15% по сравнению с 1% в популяции [4]. Многие исследователи считают, что на генетические факторы у близнецов приходится около 60% восприимчивости к РА [5]. Неблагоприятным генетическим фактором предрасположенности к риску развития РА, возможно одним из важных, является носительство некоторых групп аллелей гена HLA-DRB1.

При популяционных исследованиях было отмечено значительное повышение частоты аллелей DRB1*04 и DRB1*01 у больных РА. При изучении этого факта Yregersen P.K и соавт. в 1987 г. обнаружили, что в позиции 70–74 в 3-й гипервариабельной области β-1-цепи гена DRB1* содержатся сходные последовательности из консервативных аминокислот (QKRAA, QRRAA и RRRAA), которые являются общим эпитопом («shared epitope» — SE), кодируются аллелями HLA DRB1*01 (01,02), DRB1*04(01,04,05,08), HLA DRB1*10, DRB1*14(02), и ассоциированы с РА [6][7].

Во многих популяциях также отмечен протективный эффект группы аллелей DRB1*13 по отношению к заболеванию РА [5].

К настоящему времени накоплено много убедительных доказательств, что именно наличие в генотипе больных аллелей DRB1*04, содержащих SE (у европейцев это — 04:01, 04:04; 04:08; в азиатских популяциях — 04:05), значительно повышает риск развития РА. У пациентов при РА, содержащих SE, под воздействием экзогенных факторов запускается воспалительная реакция в соединительной ткани, где экспрессируются неоантигены, особенно цитруллинированные протеины, которые становятся мишенью аутоиммунных реакций, и в результате активации В-клеток индуцируется гиперпродукция АЦЦП.

Установлено, что аллели HLA-DRB1, содержащие SE, чаще ассоциированы с АЦЦП-положительным РА [4]. У пациентов с высоким уровнем АЦЦП наблюдается более активное течение заболевания с повышением индекса активности заболевания DAS28 (Disease activity score, DAS28) и наблюдается быстрое прогрессирование эрозивных изменений в суставах [8][9]. Важно отметить, что при РА коморбидные заболевания встречаются чаще, чем в популяции. Все они усугубляют неблагоприятный жизненный прогноз и потерю трудоспособности [10].

К настоящему времени, благодаря своевременному применению в лечении базисных противовоспалительных препаратов и многочисленных современных генно-инженерных препаратов, которые блокируют выработку «провоспалительных» цитокинов и/или активацию -Т и -В лимфоцитов произошло улучшение результатов лечения РА¹ [9][11]. Однако остаются сложности в диагностике раннего РА.

Определение состава аллелей гена HLA DRB1 у пациента с подозрением на РА может быть дополнительным исследованием для диагностики, прогноза течения заболевания и своевременного начала лечения.

Важно отметить, что в клинических рекомендациях РА обращено внимание на высокий риск развития и прогрессирования заболевания у пациентов-носителей HLA-DRB1*01/DRB1*04, имеющих +SE. Носительство HLA-DRB1*04:01 выявляется у 50–61% пациентов с РА, а HLA-DRB1*04:04 у 27–37% [9].

Использовать в широкой клинической практике определение SE аллелей на данный момент пока довольно сложно. Но учитывая, что при базовом ДНК-типировании определяются все группы аллелей гена DRB1, его возможно использовать для типирования пациентов с подозрением на РА для ранней диагностики заболевания.

В лаборатории иммунологического типирования тканей (ЛИТТ) ГБУ РО «СПК» по направлениям лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) проводится определение группы аллелей гена HLA DRB1 и серологическое типирование антигенов HLA-A, -B у пациентов с ревматическими воспалительными заболеваниями для ранней диагностики, в основном у пациентов с подозрением на РА и анкилозирующий спондилоартрит (АС).

Цель исследования — ретроспективный анализ результатов, полученных при типировании антигенов HLA-A, -B и групп аллелей HLA DRB1 у больных ревматоидным артритом в Ростовской популяции.

Материалы и методы

В течение 2019–2020 гг. нами проводилось типирование антигенов системы HLA I класса (HLA-A, HLA-B) и HLA II класса (ген DRB1) у пациентов с воспалительными ревматическими заболеваниями, находившихся на стационарном лечении в ревматологическом отделении Государственного бюджетного учреждения Ростовской области «Областной клинической больницы №2».

Для постановки диагноза РА использовали общепринятые в ревматологии клинические, лабораторные и инструментальные исследования по классификационным критериям American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR) rheumatoid arthritis 2010 г. Воспалительную активность оценивали по индексу DAS 28.

Всего типировано 194 пациента, у 41 (21,13%) из них диагностирован РА.

В общей группе пациентов (n – 41) медиана индекса активности DAS28 имела величину 5,85 (таблица 1). Все пациенты (9 мужчин, 32 женщины, медиана возраста — 42 года) были типированы по 13 аллелям гена HLA II класса DRB1. По HLA -A, -B (I класс) типировано 39 больных РА. Кроме того, нами был проведён анализ частот антигенов HLA I класса и аллелей HLA II класса в группах серопозитивного и серонегативного РА.

Серопозитивный РА диагностирован у 18 пациентов (2 мужчин, 16 женщин, медиана возраста — 40,5 лет), медиана индекса DAS28 — 6,4 (Таблица 1). В группе серонегативного ревматоидного артрита было 23 пациента (7 мужчин, 16 женщин, медиана возраста — 43 года), медиана индекса активности DAS28 равнялась 5,8.

Типирование антигенов HLA-A,-B I класса проводили стандартным микролимфоцитотоксическим тестом диагностическими реагентами фирмы DILEN (Чешская республика). Лимфоциты выделяли в градиенте плотности «Лимфолот» (фирма DILEN, Чешская республика).

Определение 13 групп аллелей гена DRB1 HLA II класса проводили полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени на амплификаторе ДТ-лайт реагентами HLA-ДНК-ТЕХ. Для выделения ДНК использовали комплект Проба-Рапид-Генетика ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия).

Контрольная группа представлена здоровыми жителями Ростовской популяции (доноры регистра гемопоэтических стволовых клеток, n – 694) ранее типированных по 5 генам HLA-A*, -B*, -C*, DRB1*, DQB1* методом PCR-SSP (базовое разрешение) с детекцией в агарозном геле, с использованием электрофореза [12]. Выделение ДНК и все исследования выполнены реактивами фирмы «Protrans» (Германия). Показатели (частота аллеля — pf, частота гена — gf) здоровых жителей популяции были рассчитаны с использованием компьютерной программы «Арлекин», версия 3.А.

По результатам типирования больных нами проведён анализ распределения частоты антигенов HLA-A,-B и аллелей гена HLA DRB1 у больных РА в Ростовской популяции, а также проведён сравнительный анализ с частотой HLA-специфичностей в контрольной группе.

Статистически достоверные различия в группе «больной-здоровый» оценивали по критерию x². Использовали формулу с поправкой Йетса на непрерывность малых выборок. Значение x² =3,841 соответствует показанию разницы (p<0,05) в сравниваемых группах. Силу ассоциации с заболеванием определяли показателем относительного риска (RR), вычислением этиологической (EF) и превентивной (PF) фракции [13][14].

Результаты

Ретроспективный анализ типирования по антигенам HLA I класса у пациентов с диагнозом РА показал следующие результаты.

В общей группе пациентов статистические различия в частоте распределения антигенов локусов HLA-А и -В по сравнению с контролем не выявлены (Таблица 2).

В таблице 3 представлен сравнительный анализ распределения частоты HLA-A, -B в группах пациентов с серонегативным и серопозитивным РА по сравнению с контролем. В группе серонегативного ревматоидного артрита отмечено повышение частоты HLA A1(x² — 6,43; p<0,05; RR — 3,21; EF — 0,31) и B8 (x² — 4,24; p<0,05; RR — 2,94; EF — 0,18) и снижение частоты HLA B35 (x² — 4,45; p<0,05; RR — 0,18; PF — 0,16).

Результаты анализа ДНК-типирования HLA II класса гена DRB1 по распределению частоты его аллельных групп, проведённого у 41 пациента с РА (общая группа), представлены в таблице 4. В Ростовской популяции среди здоровых жителей частота группы аллелей HLA DRB1*04 составляет 20%, в общей группе у больных РА она равна 46,3% и достоверно повышена (x² — 14,36; р<0,001; RR — 3,4; EF — 0,33).

У пациентов в общей группе по сравнению с контролем отмечено снижение частоты аллелей HLA DRB1*11(x² — 4,45, p<0,05; RR — 0,43; PF — 0,16) и HLA DRB1*13 (x² — 5,43; p<0,02; RR — 0,33; PF — 0,23).

При серопозитивном РА по сравнению с контролем (таблица 5) аллели DRB1*04 встречаются у 61,1% пациентов (x² — 15,42; p <0,001; RR — 6,27; EF — 0,51). При серонегативном РА частота аллелей DRB1*04 также повышена (34,8%), однако статистически достоверные отличия не выявлены (x² — 2,13; p <0,05; RR — 2,14; EF — 0,19).

При серонегативном РА, как и в общей группе больных, снижена частота HLA DRB1*11 (x² — 5,39; p<0,05; RR — 0,24; PF — 0,21) и DRB1*13 (x² — 3,93; p<0,05; RR — 0,30; PF — 0,23).

Проведено сравнение некоторых клинических показателей у пациентов с РА при наличии в генотипе HLA DRB1*04 (46,4%) и не имеющих (53,6%) данную группу аллелей (таблица 6).

У 89,5% пациентов с DRB1*04 отмечено поражение крупных суставов (коксартроз, гонартроз и др.) по сравнению с больными, не имеющих данных аллелей (59,1%). Двусторонний сакроилиит выявлен у 84,2% пациентов с DRB1*04 и у 77,2% при их отсутствии. В сравниваемых группах отмечено, что у пациентов-носителей DRB1*04 уже при медиане возраста 39 лет чаще выявляются поражения суставов (ФК 2, 2-3, 3), такие же, как и у пациентов в более позднем возрасте (медиана — 48 лет), не несущих данные аллели. Всё вышеперечисленное косвенно даёт возможность предположить, что именно наличие в генотипе HLA DRB1*04 утяжеляет и усиливает эрозивно-деструктивные поражения суставов у пациентов с РА.

Обсуждение

Анализ антигенов HLA I класса показал, что у пациентов с серонегативным РА по сравнению с контролем наблюдается повышение частоты антигенов HLA-A1 (45,4% (контроль — 20,6%)) и HLA-B8 (27,2% (контроль — 10,8%)). Не исключено, что при серонегативном РА у больных повышена частота антигена HLA-В8 вследствие наличия коморбидных аутоимунных заболеваний, которые ассоциированы с данным антигеном. А повышение частоты антигена HLA-А1 объясняется высоким неравновесным сцеплением между антигенами А1 и В8.

Повышение частоты антигенов HLA-A1 и -B8 и снижение частоты антигена HLA-B35 у пациентов при серонегативном РА требует дальнейшего анализа в более многочисленной группе пациентов.

По результатам типирования генов HLA II класса установлено, что при РА аллели HLA DRB1*04 в общей группе пациентов встречаются достоверно в 2,4 раза чаще, а при серопозитивной форме болезни — в 3,1 раза чаще, чем в популяции здоровых жителей нашего региона.

Необходимо отметить, что во всех трёх анализируемых группах наблюдается некоторое повышение частоты группы аллелей DRB1*01 (общая группа — 26,8%; серопозитивный артрит — 27,7%; серонегативный — 26,1%) по сравнению с контролем (19,6%).

В Ростовской популяции отмечено снижение частоты HLA DRB1*11 (p<0,05) и HLA DRB1*13 (p<0,02) в общей группе пациентов РА и при серонегативной форме болезни (p<0,05). Протективная функция HLA-DRB1*13 неоднократно отмечена в литературных источниках в разных регионах мира и в России [5]. Вероятнее всего, и в нашей популяции подтверждается его протективное действие. Факт снижения частоты аллеля HLA-DRB1*11 интересен и требует дальнейшего анализа на большей группе пациентов с РА.

Заключение

Необходимо отметить, что в настоящее время типирование HLA I и II класса пока не предусмотрено стандартами медицинской помощи и клиническими рекомендациями при тяжелых инвалидизирующих заболеваниях — РА и анкилозирующем спондилите (АС). Однако Ассоциация ревматологов России рекомендует использовать результаты HLA типирования на наличие у пациента антигена HLA B27 в качестве вспомогательного диагностического критерия АС. А многочисленные исследования гена HLA DRB1, проведённые в последние годы в ряде популяций мира и в России, показали, что наличие в генотипе аллеля DRB1*04 позволяет отнести пациента в группу риска по развитию РА [4][5][6]. Поэтому результаты HLA-типирования так же важны для диагностики раннего РА, как и АС, так как оба заболевания в дебюте имеют похожую симптоматику. И клиницисту наряду с основными обследованиями пациента (лабораторными и инструментальными) для постановки диагноза на ранних стадиях заболевания, желательно учитывать результаты типирования HLA I и II класса, которые открывают возможности для ранней диагностики заболеваний и своевременного выстраивания тактики лечения пациента. Это позволяет искать индивидуальный подход к постановке правильного диагноза с учетом симптоматики и механизмами патогенеза заболевания. А также необходимый контроль модифицируемых факторов риска (ожирение, курение и др.) и правильный выбор проведения лекарственной терапии.

Эффективное лечение позволит пациенту достичь состояния ремиссии или снижения активности заболевания и предотвратить необратимые повреждения внутренних органов.

В заключение ещё раз важно подчеркнуть, что в Ростовской популяции значительное повышение аллелей HLA DRB1*04 (46,3% — общая группа, 61,1% — серопозитивная форма) и уровень достоверности (p<0,001) с высокой вероятностью указывает на ассоциативную связь данной группы аллелей с заболеванием ревматоидный артрит.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.